YIJI细胞沉默调节蛋白3 （SIRT3）活性荧光定量检测试剂盒（中文版）
主要用途
YIJI细胞沉默调节蛋白3 （SIRT3）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆素标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT3脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素，即采用荧光法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、线粒体蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中SIRT3的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，是进化保留的古老的酶类，存在于真核生物、古生菌（Archaea）和真细菌（Eubacteria）等，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。其中可溶性SIRT3位于细胞线粒体内，体内热量限制（caloric restriction）、寒冷刺激、细胞应激等因素，使成熟且活性Sirt3由细胞核转移到线粒体，经基质加工肽酶（matrix-processing peptidase）激活，表达增加，作用于乙酰辅酶A合酶2（acetyl CoA synthetase 2）、UCP1、PGC-1α等天然目标底物，脱乙酰化和激活。其功能在于调节适应性生热反应（thermogenesis）、确保能量产生、提供乙酸的代谢使用、调节基础ATP水平、调节影响线粒体通透性的凋亡信号、调节表观遗传基因沉默，是代谢或氧化状态的感应因子，生命延长（life extension）的标志。Sirt3异常，将导致神经退行性疾病、癌症、衰老、代谢功能异常等疾病。基于人工合成的乙酰化p53多肽底物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用荧光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；AMC）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激发波长350-360nm；散发波长450-465nm），由此来定量测定沉默调节蛋白3的活性。其反应系统为：
Sirt3
Ac-Gln-Pro-Lys-Lys（Ac）-AMC + NAD → Ac- Gln-Pro -Lys-Lys-AMC + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose
氨基肽酶
Ac-Arg-His-Lys-Lys-AMC → Ac-Arg—His-Lys-Lys + AMC
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 100毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 25毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 3毫升
YIJI底物液（Reagent D） 50微升
YIJI终止液（Reagent E） 200微升
YIJI酶解液（Reagent F） 200微升
YIJI补充液（Reagent G） 500微升
YIJI标准液（Reagent H） 50微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI缓冲液（Reagent C）、YIJI底物液（Reagent D）、YIJI终止液（Reagent E）、YIJI酶解液（Reagent F）和YIJI标准液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent D）和YIJI标准液（Reagent H）避免光照，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
5毫升DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
培养箱：用于反应物孵育
黑色96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于反应和荧光分析的容器
荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备（线粒体蛋白）
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心抽去培养液
3． 小心加入5毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖细胞生长表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入1毫升YIJI裂解液（Reagent B），混匀细胞
7． 移入到预冷的5毫升DOUNCE匀浆器
8． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）
9． 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管
10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1500g
11． 小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管
12． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
14． 加入200微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YIJI30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如线粒体蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2． 设定好荧光酶标仪或荧光分光光度仪（温度为30℃）：激发波长350-360nm；散发波长450-465nm
3． YIJI缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度
4． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
5． 分别加入25微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1至5号管
6． 移取25微升YIJI标准液（Reagent H）到1号管，混匀
7． 小心移取25微升1号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到2号管，混匀
8． 小心移取25微升2号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到3号管，混匀
9． 小心移取25微升3号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到4号管，混匀
10． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
三、标准测定
1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品1至5管
2． 分别移取80微升YIJI缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3． 分别加入20微升上述配制的YIJI标准液（Reagent H）
4． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
5． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数
6． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）
四、活性测定
1． 在黑色96孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
2． 分别移取58微升YIJI缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3． 分别加入2微升YIJI底物液（Reagent D）
4． 分别加入20微升YIJI补充液（Reagent G）或待测样品（50微克线粒体蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
6． 放进30℃培养箱里，孵育60分钟，避免光照
7． 分别加入10微升YIJI终止液（Reagent E）
8． 分别加入10微升YIJI酶解液（Reagent F）
9． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
10． 在30℃培养箱里，孵育30分钟
11． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升1厘米光径比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数
12． 根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）
四、 计算样品活性
方法一：RFU直接法
根据样品的荧光读数RFU作为样品酶活性单位
方法二：标准氨甲基香豆素浓度测算法
[根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数] ÷60（反应时间；分钟]＝纳摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克/分钟
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准测定只需1次
4． 注意增益倍数的设置
5． 样品须澄清，至关重要
6． 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
7． 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
8． 测定值由低到高变化；测定持续60分钟
9． 测定值荧光读数越高，表明酶活性越高
10． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底
11． 待测样本为线粒体蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/20微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒YIJI30030.1）
12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13． 样品活性计算根据用户要求，选择直接法或测算法；如果选择直接法，可以不必测定标准样品
14． 沉默调节蛋白3单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够释放1纳摩尔氨甲基香豆素所需的酶量作为一个活性单位
15． 本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
主要用途
YIJI细胞沉默调节蛋白3 （SIRT3）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆素标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT3脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素，即采用荧光法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、线粒体蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中SIRT3的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，是进化保留的古老的酶类，存在于真核生物、古生菌（Archaea）和真细菌（Eubacteria）等，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。其中可溶性SIRT3位于细胞线粒体内，体内热量限制（caloric restriction）、寒冷刺激、细胞应激等因素，使成熟且活性Sirt3由细胞核转移到线粒体，经基质加工肽酶（matrix-processing peptidase）激活，表达增加，作用于乙酰辅酶A合酶2（acetyl CoA synthetase 2）、UCP1、PGC-1α等天然目标底物，脱乙酰化和激活。其功能在于调节适应性生热反应（thermogenesis）、确保能量产生、提供乙酸的代谢使用、调节基础ATP水平、调节影响线粒体通透性的凋亡信号、调节表观遗传基因沉默，是代谢或氧化状态的感应因子，生命延长（life extension）的标志。Sirt3异常，将导致神经退行性疾病、癌症、衰老、代谢功能异常等疾病。基于人工合成的乙酰化p53多肽底物Ac- Gln-Pro -Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用荧光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；AMC）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激发波长350-360nm；散发波长450-465nm），由此来定量测定沉默调节蛋白3的活性。其反应系统为：
Sirt3
Ac-Gln-Pro-Lys-Lys（Ac）-AMC + NAD → Ac- Gln-Pro -Lys-Lys-AMC + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose
氨基肽酶
Ac-Arg-His-Lys-Lys-AMC → Ac-Arg—His-Lys-Lys + AMC
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 100毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 25毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 3毫升
YIJI底物液（Reagent D） 50微升
YIJI终止液（Reagent E） 200微升
YIJI酶解液（Reagent F） 200微升
YIJI补充液（Reagent G） 500微升
YIJI标准液（Reagent H） 50微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI缓冲液（Reagent C）、YIJI底物液（Reagent D）、YIJI终止液（Reagent E）、YIJI酶解液（Reagent F）和YIJI标准液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent D）和YIJI标准液（Reagent H）避免光照，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
5毫升DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
培养箱：用于反应物孵育
黑色96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于反应和荧光分析的容器
荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备（线粒体蛋白）
1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2． 小心抽去培养液
3． 小心加入5毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖细胞生长表面
4． 小心抽去清理液
5． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6． 加入1毫升YIJI裂解液（Reagent B），混匀细胞
7． 移入到预冷的5毫升DOUNCE匀浆器
8． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）
9． 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管
10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1500g
11． 小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管
12． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒
14． 加入200微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YIJI30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如线粒体蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2． 设定好荧光酶标仪或荧光分光光度仪（温度为30℃）：激发波长350-360nm；散发波长450-465nm
3． YIJI缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度
4． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
5． 分别加入25微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1至5号管
6． 移取25微升YIJI标准液（Reagent H）到1号管，混匀
7． 小心移取25微升1号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到2号管，混匀
8． 小心移取25微升2号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到3号管，混匀
9． 小心移取25微升3号管稀释的YIJI标准液（Reagent H）到4号管，混匀
10． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
| 管号 | YIJI缓冲液（Reagent C） | YIJI标准液（Reagent H） | 标准氨甲基香豆素浓度 |
| 1 | 25微升 | 25微升 | 10微摩尔/升 |
| 2 | 25微升 | 25微升1号管 | 5微摩尔/升 |
| 3 | 25微升 | 25微升2号管 | 2.5微摩尔/升 |
| 4 | 25微升 | 25微升3号管 | 1.25微摩尔/升 |
| 5 | 25微升 | 0 | 0 |
三、标准测定
1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品1至5管
2． 分别移取80微升YIJI缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3． 分别加入20微升上述配制的YIJI标准液（Reagent H）
4． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
5． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数
6． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）
四、活性测定
1． 在黑色96孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
2． 分别移取58微升YIJI缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3． 分别加入2微升YIJI底物液（Reagent D）
4． 分别加入20微升YIJI补充液（Reagent G）或待测样品（50微克线粒体蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
6． 放进30℃培养箱里，孵育60分钟，避免光照
7． 分别加入10微升YIJI终止液（Reagent E）
8． 分别加入10微升YIJI酶解液（Reagent F）
9． 轻轻摇动黑色96孔板30秒
10． 在30℃培养箱里，孵育30分钟
11． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升1厘米光径比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数
12． 根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）
四、 计算样品活性
方法一：RFU直接法
根据样品的荧光读数RFU作为样品酶活性单位
方法二：标准氨甲基香豆素浓度测算法
[根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数] ÷60（反应时间；分钟]＝纳摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克/分钟
注意事项
1． 本产品为20次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准测定只需1次
4． 注意增益倍数的设置
5． 样品须澄清，至关重要
6． 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
7． 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
8． 测定值由低到高变化；测定持续60分钟
9． 测定值荧光读数越高，表明酶活性越高
10． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底
11． 待测样本为线粒体蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/20微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒YIJI30030.1）
12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
13． 样品活性计算根据用户要求，选择直接法或测算法；如果选择直接法，可以不必测定标准样品
14． 沉默调节蛋白3单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够释放1纳摩尔氨甲基香豆素所需的酶量作为一个活性单位
15． 本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
